Małe RNA, AURE i translacja

W Science pojawiła się kolejna ciekawa praca z serii “zagadki małych RNA”, tym razem o związkach sekwencji bogatych w AU (AURE) w 3′UTR (czyli “tylnym”, niekodującym już białka, końcu mRNA) z miRNA. Dotychczas sekwencje AURE znane były głównie z tego, że zawierające je mRNA mają bardzo krótki czas półtrwania w komórce, jednak pod wpływem różnorodnych czynników, np. stresu czy zapalenia, ulegają stabilizacji i zamiast żyć kilka minut, rozpadają się dopiero po kilku(nastu) godzinach. Poza tym elementy AURE mogą wpływać na tempo translacji zawierających je RNA. Poznano już całkiem sporo białek, które wiążą się z tymi sekwencjami i wpływają na stabilność oraz translację niosących je cząsteczek. Małe RNA natomiast biorą udział w wyciszaniu ekspresji genów w procesie interferencji RNA, choć wygląda na to, że nie jest to ich jedyna funkcja.

Strażnik genomu

“Strażnikiem genomu” nazywa się zwykle białko p53. Hamuje ono podziały komórek z uszkodzonym DNA, i bierze udział w aktywacji mechanizmów naprawy DNA oraz uruchamianiu programu samobójczej śmierci komórki, czyli apoptozy. Niektóre uszkodzenia DNA mogą powodować zatrzymanie transkrypcji - polimeraza RNA zatrzymuje się np. na dimerach pirymidynowych. Zatrzymana polimeraza RNA II jest rozpoznawana przez specjalną klasę białek, które wiążą się do niej i do białek zaangażowanych w naprawę DNA, które następnie wycinają uszkodzone nukleotydy. Taki mechanizm nazywany jest naprawą sprzężoną z transkrypcją TCR. Stwierdzono też, że aktywacja p53 w odpowiedzi na UV następuje, gdy uszkodzenia pojawiają się w aktywnych transkrypcyjnie genach, oraz, że związki blokujące transkrypcję przez polimerazę RNA II powodują aktywację p53. Czyli istnieje związek między zatrzymaniem transkrypcji a aktywnością “strażnika genomu”.

Znikające transkrypty, czyli NMD w neuronach

NMD (nonsense-mediated mRNA decay) to proces niszczenia transkryptów zawierających przedwczesny kodon STOP. Selekcja mRNA, które zostaną zniszczone, jest związana ze splicingiem albo z terminacją translacji (Amrani 2006). To, czy kodon STOP zostanie uznany za prawidłowy, czy też za nieprawidłowy, zależy od kontekstu. Sekwencja położona za kończącym sekwencję kodującą prawidłowym kodonem STOP to tzw. 3′UTR (obszar nieulegający translacji). Na jego obszarze znajdują się różne sekwencje sygnałowe, do których mogą się wiązać białka. Długość tej sekwencji i związane z nią białka odgrywają rolę w określeniu, czy transkrypt zawiera prawidłowy, czy też przedwczesny kodon STOP. Wycięcie prawdziwej sekwencji kodującej za nieprawidłowym kodonem STOP może spowodować, że komórka uzna go za kodon prawidłowy, a sztuczne przedłużenie 3′UTR może spowodować, że prawidłowy kodon STOP zostanie rozpoznany jako przedwczesny. Rozpoznawanie przedwczesnych kodonów STOP ma też związek z wycinaniem intronów. U ssaków STOP jest rozpoznawany jako przedwczesny, kiedy poniżej (czyli w kierunku 3′) związane są białka tworzące kompleks EJC (exon-junction complex). EJC wiąże się do mRNA na granicy egzon-intron podczas splicingu i tam już zostaje. Białka te mogą pomagać przy rekrutacji rybosomów, jeśli znajdują się na obszarze sekwencji kodującej, ale jeśli znajdują się na obszarze 3′UTR, mogą skierować taki transkrypt na ścieżkę degradacji. Poza tym mRNA może być skierowane do degradacji związanej z NMD tylko na początku translacji. Wydaje się, że spowodowane to jest zmianą białek związanych z transkryptem w wyniku pierwszego przejścia rybosomu, m. in. usunięciem z mRNA kompleksu EJC.

Niedokończona transkrypcja

Ekspresja genów jest regulowana na wielu poziomach. Bardzo istotna jest regulacja transkrypcji - czyli przepisywania informacji z DNA na RNA. Kontrolowane są także dalsze etapy. Ważną rolę w regulowaniu poziomu białka w komórce może odgrywać czas półtrwania kodującego je mRNA, wydajność translacji czy kontrolowana degradacja białka. O wszystkich tych procesach wiemy już całkiem sporo. Ostatnie badania wykazują jednak, że nawet regulacja startu transkrypcji kryje jeszcze sporo niespodzianek. Wstępne wyniki projektu ENCODE przyniosły między innymi informację, że transkrybowana jest znacznie większa część genomu, niż dotąd sądzono, także sekwencje, które wydają się nie pełnić żadnej funkcji. Może to oznaczać, że jakieś funkcje jednak mają, ale równie dobrze może się okazać, że są to “szumy” wynikające z niedokładnej regulacji transkrypcji.

Hydra, sfinks i inne potwory, czyli nowe geny muchy

Gatunki różnią się od siebie między innymi liczbą genów. Zatem naukowcy szukają takich genów, które pojawiły się stosunkowo niedawno, i próbują ustalić, skąd się wzięły i jak ewoluowały. Nowe geny mogą powstawać na kilka sposobów (Long i in. 2003):

• przez duplikację - nowa kopia zaczyna pełnić nową funkcję, a wyjściowa zachowuje starą. Duplikacji może też ulec fragment chromosomu zawierający więcej genów, lub nawet cały genom.

• przez tasowanie egzonów (exon shuffling) - nowe geny powstają w wyniku rekombinacji łączącej ze sobą egzony, które do tej pory znajdowały się w różnych genach, czasem zaś egzony ulegają duplikacji zmieniając w ten sposób sekwencję białka.

• przez retrotranspozycję - nowy gen powstaje przez odwrotną transkrypcję mRNA starego genu i umieszczenie tej sekwencji w innym miejscu genomu. Nowa kopia musi trafić w okolice sekwencji, które posłużą jako sekwencje regulatorowe, żeby zacząć działać. Czasem może też wykorzystać fragment sekwencji kodującej genu, który znajdował się w miejscu docelowym.

• przez integrację elementów ruchomych (np. sekwencji Alu) do sekwencji już istniejącego genu.

• przez poziomy transfer genów - bakterie różnych gatunków mogą przekazywać sobie geny. Takie zjawisko obserwowano też kilkakrotnie u roślin i pierwotniaków. Czasem ten proces także odbywa się z udziałem elementów ruchomych.

• przez fuzję i podział genów - dwa sąsiadujące geny mogą skleić się w jeden, kiedy np. mutacji (lub delecji) ulegnie kodon stop i sygnał do terminacji transkrypcji pierwszego genu. Mechanizm podziału genu na dwa nie został jeszcze poznany.

• przez powstawanie od nowa z sekwencji niekodujących.

• i oczywiście przez kombinację tych mechanizmów.

Przeskoczyć egzon

Dystrofie mięśniowe Duchenne’a (DMD) i Beckera (BMD) to choroby genetyczne wywołane mutacjami w genie kodującym dystrofinę. Przyczyną choroby mogą być delecje jednego lub więcej egzonów, duplikacje egzonów oraz mutacje punktowe (przedwczesne kodony stop i uszkodzone miejsca splicingowe). Jeśli mutacja wprowadza przedwczesny kodon STOP lub powoduje przesunięcie ramki odczytu tak, że dystrofina nie powstaje w ogóle lub jest na tyle skrócona, że całkowicie traci funkcjonalność, wynikiem jest dystrofia Duchenne’a, która pojawia się wcześniej i ma dużo cięższy przebieg. Jeśli mutacje powodują usunięcie fragmentu ze środka białka, ale może ono nadal częściowo pełnić swoje funkcje, mówimy o dystrofii Beckera, która zaczyna się później i ma łagodniejszy przebieg. Wiele grup badawczych pracuje nad sposobami zwalczania tych chorób. Jedni próbują nauczyć rybosom przeskakiwać nieprawidłowe kodony STOP, inni modyfikują splicing za pomocą antysensownych oligonukleotydów (czyli krótkich jednoniciowych cząsteczek zbudowanych z kilku - kilkudziesięciu zasad komplementarnych do sekwencji pre-mRNA dystrofiny).

RNAi i Ebola

Interferencja RNA (RNAi) u roślin czy nicieni jest wykorzystywana jako mechanizm chroniący przed wirusami. Podczas infekcji dwuniciowe RNA wirusa aktywuje RNAi - zostaje pocięte przez białko Dicer na krótkie kawałki (siRNA), które następnie łączą się z komplementarnym wirusowym mRNA, co stanowi sygnał do jego degradacji przez białka komórki. Nie od razu udało się wykazać, że także u ssaków RNAi odgrywa rolę w obronie przed wirusami. U ludzi trudno znaleźć siRNA specyficzne dla wirusa - wykryto tylko siRNA specyficzne dla HIV-1 i retrotranspozonu LINE-1. Niektórzy naukowcy uznali zatem, że ssaki nie korzystają z tego mechanizmu w obronie przed wirusami, gdyż zastąpiły je innymi - np. odpowiedzią z udziałem interferonu.

Argonauci i translacja

Interferencja RNA (RNAi) to wyciszanie ekspresji genów, odbywające się albo przez degradację docelowego transkryptu, albo przez zahamowanie jego translacji. Niedawno opisywałam wyniki sugerujące, że hamowanie translacji polega na uniemożliwieniu składania rybosomu na transkrypcie, w którym bierze udział białko eIF6, i że to, co dotychczas brano za rybosomy na wyciszonych mRNA, wcale nimi nie jest. Jednak to nie wszystko. W kompleksie RISC, który bierze udział w interferencji RNA, znajdują się też białka z rodziny Ago (Argonauta). Mogą one przecinać transkrypt, ale na tym ich rola się nie kończy. Prawdopodobnie biorą też udział w represji translacji, ale mechanizm tego działania nie jest znany.

Chromosom na niedzielę - chromosom 10

Chromosom 10 ma 132 mln par zasad. Znajduje się na nim 1787 genów, w tym 816 kodujących białka, i 430 pseudogenów. 85 loci na tym chromosomie wiąże się z chorobami, jak zwykle kilka przykładów można znaleźć w Wikipedii. U szympansów, goryli i makaków, ale także u kotów można znaleźć homologiczny chromosom, natomiast u małpiatek i małp szerokonosych, a także u wielu innych ssaków (foki, łasice, ryjówki, konie) bloki sekwencji homologicznych do naszego chromosomu 10 znajdują się na dwóch chromosomach (a czasem nawet na trzech). Część naukowców opowiadała się za hipotezą, że wspólny przodek ssaków łożyskowych miał jeden chromosom homologiczny do chromosomu 10, jednak nowsze badania sugerują, że miał on dwa chromosomy, z których jeden odpowiadał dłuższemu, a drugi krótszemu ramieniu naszego chromosomu 10.

Dlaczego męczy nas HIV

Nasz genom nosi w sobie ślady infekcji sprzed milionów lat. To sekwencje pochodzące od retrowirusów - wirusów, których informacja genetyczna zapisana jest w cząsteczce RNA. Po wniknięciu wirusa do komórki gospodarza jest ona przepisywana na DNA za pomocą odwrotnej transkryptazy. To wirusowe DNA może ulec integracji do genomu gospodarza i replikować się razem z nim. Od czasu do czasu jest ono transkrybowane na RNA, na podstawie którego znów może powstać cząsteczka DNA, i znów włączyć się do genomu gospodarza. Jeśli wirusowi uda się integracja do chromosomu w komórce rozrodczej, będzie przekazywany potomkom zainfekowanego organizmu. Jeśli jest w genomie wystarczająco długo, mutacje mogą uniemożliwić produkcję kompletu białek wirusowych, a zatem infekcję kolejnych komórek. Retrowirusy będące już stałą częścią genomu określa się jako retrowirusy endogenne. Kilka miesięcy temu na podstawie sekwencji nieaktywnych retrowirusów endogennych rozsianych po naszych chromosomach dwie grupy naukowców, francuska i amerykańska, niezależnie odtworzyły przodka ludzkich retrowirusów endogennych HERV-K i wykazały, że potrafi infekować komórki.

Encyklopedia DNA

Genom ludzki odsłania kolejne tajemnice. Projekt ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements) ma na celu identyfikację wszystkich funkcjonalnych elementów w ludzkim genomie. W Nature ukazało się sprawozdanie z pierwszej części projektu - badań nad 1% ludzkiego genomu. Zanalizowano 44 fragmenty genomu (ok. 30 Mbp). Połowa z tych miejsc została wybrana, ponieważ już sporo o nich wiadomo, a druga połowa jest losową próbą. Równocześnie Genome Research publikuje inne prace związane z tym projektem. Artykuły są dostępne za darmo, a jako bonus dołączono plakat w pdf, opisujący część wyników.

Ryboprzełączniki i splicing alternatywny

Ryboprzełączniki to fragmenty RNA potrafiące regulować ekspresję białka kodowanego przez mRNA, którego są częścią, w odpowiedzi na sygnały chemiczne płynące ze środowiska. Ryboprzełącznik zbudowany jest z dwóch domen. Pierwsza to aptamer, który może wiązać małe cząsteczki, np. witaminy. Druga to tzw. platforma ekspresyjna. Kiedy aptamer zwiąże się z odpowiednią cząsteczką, platforma ekspresyjna zmienia swoją strukturę przestrzenną. Ta zmiana wpływa na transkrypcję lub translację mRNA, w którym znajduje się ryboprzełącznik. Bromek Etydyny napisał parę słów o tych zmyślnych cząsteczkach i ich zastosowaniach.

W komórce po polsku

Filmy poniżej (replikacja DNA, transkrypcja i translacja) pochodzą podobno z książki “Podstawy biologii komórki” (”Essential Cell Biology”) wydanej przez PWN.

Małe RNA a translacja

Wyciszanie ekspresji genów za pomocą małych cząsteczek RNA (miRNA), czyli interferencja RNA (RNAi), zostało opisane stosunkowo niedawno. Zatem nic dziwnego, że nie wszystko jest jeszcze jasne. Wygląda jednak na to, że udało się rozwikłać ważny problem. RNAi działa na dwóch poziomach. miRNA przyczepia się do wyciszanego mRNA i powoduje zahamowanie translacji białka kodowanego przez to mRNA lub degradację transkryptu. Jednak zagadką jest, na którym etapie odbywa się to blokowanie translacji. Część wyników wskazywała, że dzieje się to przed lub w trakcie inicjacji translacji. Przemawiał za tym fakt, że wyciszanie ekspresji nie zachodzi, kiedy docelowe mRNA nie ma czapeczki na 5′-końcu, która zazwyczaj jest konieczna do rozpoczęcia translacji. Również transkrypty zawierające tzw. wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu (IRES), które pozwala na niezależną od czapeczki inicjację translacji, nie dawały się wyciszyć (Pillai i in. 2005). Jednak część wyników sugerowała, że blokada translacji następuje później, ponieważ wielokrotnie stwierdzano, że do wyciszanych mRNA związane już były rybosomy, czyli kompleksy białko-RNA, które prowadzą translację. Zatem jak jest naprawdę?

Wycinanka 2, czyli rekordowa mucha

Jak już wspomniałam, rekord w ilości potencjalnych wariantów splicingowych przypadł genowi Dscam (Down syndrome cell adhesion molecule) muszki owocowej D. melanogaster. Z jednego genu może ich powstać 38 016. mRNA dla tego genu ma 7,8 tys. zasad i składa się z 24 egzonów. Dla czterech z nich istnieje po kilka wariantów, z których tylko jeden zostaje w dojrzałym mRNA. Egzon 4 ma 12 wariantów, egzon 6 aż 48, egzon 9 aż 33, a egzon 17 tylko dwa warianty. Egzon 17 koduje domenę transmembranową, a pozostałe egzony domeny białka, które wystają poza komórkę. Kiedy badacze sprawdzili, czy są one wykorzystywane, na 50 prób znalezli 49 unikalnych transkryptów. Poniewaz Dscam ulega ekspresji w ukladzie nerwowym, gdzie służy jako “przewodnik” dla rosnących aksonów, zasugerowali, ze ta różnorodność może być związana ze specyficznoscią połączeń neuronalnych (Schmucker i in. 2000).