Chroniczne zmęczenie wirusem

Syndrom chronicznego zmęczenia (zespół przewlekłego zmęczenia, CFS) to dość kontrowersyjna diagnoza. Stawia się ją wtedy, kiedy wykluczy się inne przyczyny przedłużającego się zmęczenia i jeszcze kilku objawów. Część lekarzy uważa, że CFS ma podłoże psychologiczne. Inni są bardziej powściągliwi i mówią tylko, że przyczyna jest nieznana, czasem dodając, że prawdopodobnie to, co diagnozuje się obecnie jako CFS, to tak naprawdę kilka różnych chorób z różnymi przyczynami. Wśród możliwych przyczyn wymienia się infekcje, problemy z powrotem do zdrowia po chorobie, i inne. Ale dalej nie będzie o trudnościach z diagnozą. Będzie o jednym z wirusów posądzanych o związki z CFS – XMRV, powtarzaniu wyników i retrakcjach. I tradycyjnie będzie tl;dr.

Emilio Longoni 'Sama'

Od dawna szuka się związku między CFS a infekcjami. Podejrzewano już różne wirusy, m. in. EBV czy HTLV. Dwa lata temu na liście kandydatów pojawił się XMRV – wirus podobny do mysiego wirusa białaczki, MLV, niewiele wcześniej opisany po raz pierwszy jako występujący w próbkach pobranych z niektórych nowotworów prostaty (1, 2).

Judy Mikovits i jej zespół opublikowali w Science pracę (3), w której opisywali odkrycie DNA wirusa XMRV (xenotropic murine leukemia virus–related virus) u 68 ze 101 pacjentów ze zdiagnozowanym CSF  (czyli u 67%). Spośród 218 zdrowych osób wirusa udało się wykryć tylko u 8  (3.7%). Oczywiście na podstawie tych wyników nie można było od razu mieć pewności, że XMRV wywołuje CFS. Po pierwsze trzeba je było niezależnie powtórzyć. Po drugie skoro wykryto sekwencje XMRV tylko u części pacjentów, to równie dobrze mogłoby się okazać, że chorzy na CFS są bardziej podatni na tą infekcję, albo że jako CFS diagnozuje się kilka różnych rzeczy.

Ale przede wszystkim wynik musi być powtórzony. Wkrótce więc rozpoczął się wysyp publikacji z różnych stron świata, których autorzy szukali XMRV u pacjentów z CFS. I co? I nic, nada, niente. Co artykuł, to brak wirusa. W Chinach nic, w Niemczech nic, w UK nic, w Holandii nic, w Japonii nic. Według innych grup w Stanach także nic. Jedyna praca, która powtórzyła wynik, została opublikowana przez tę samą grupę pod wodzą Mikovits. Czyli niezależnego potwierdzenia brak.

Niektórzy przywołują co prawda jako potwierdzenie wykonaną przy wsparciu FDA pracę zespołu Altera (4), której autorzy twierdzą, że znaleźli w próbkach pobranych od pacjentów z CFS sekwencje wirusa podobnego do  wirusa mysiej białaczki, ale sami autorzy podkreślają, że nie był to XMRV. A do tego zaczęło się pojawiać coraz więcej artykułów, które sugerują, że takie sekwencje wirusów podobnych do wirusa mysiej białaczki, w tym XMRV, to jedynie zanieczyszczenia laboratoryjne. Kilka z nich można znaleźć w Retrovirology (np. cztery prace + przeglądówka od redakcji w numerze z grudnia 2010).

Jednak najciekawsze wydają się dwa świeże artykuły – zespołu Singh i zespołu Levy’ego.

Zacznijmy od pracy, która wyszła z zespołu Ili Singh (5). Jest to grupa, która bada potencjalny związek XMRV z nowotworami prostaty, więc trudno ich posądzić o to, że chcą udowodnić, że XMRV pochodzi z odczynników laboratoryjnych. Praca Singh zaczyna się od opisania niedoskonałości wcześniejszych publikacji, które nie wykazały obecności XMRV u pacjentów z CFS – niewielkich populacji kontrolnych, braku zastosowania ślepej próby u eksperymentatorów, itp. W tej pracy próbki pochodziły od 200 zdrowych ochotników i 105 pacjentów z CFS (100 pacjentów spełniało zarówno kanadyjskie jak i zaproponowane przez CDC kryteria diagnostyczne). Ponadto analizie poddano próbki krwi od 14 pacjentów, którzy brali udział w pierwszym badaniu i wg Mikovits wielokrotnie w ich krwi wykryto XMRV. Zastosowano cztery różne metody wykrywania sekwencji wirusa oparte na PCR, a do tego zbadano, czy w próbkach są przeciwciała anty-XMRV. Ponadto spróbowano wyhodować wirusy w hodowlach komórkowych stosując metodę zaproponowaną przez Mikovits jako najbardziej czuły sposób wykrywania obecności XMRV (w ten ostatni sposób przebadno tylko część próbek – 31 od pacjentów i 34 od kontroli; próbki wybrano losowo). Dodatkowo eksperymentatorzy podczas przeprowadzania doświadczeń nie wiedzieli, które próbki należą do pacjentów, a które do zdrowych ochotników.

I co? I nic. Zespół Singh nie znalazł wirusa za pomocą czułych metod qPCR, nie znalazł też białek wirusowych, ani nie wyhodował wirusa w hodowlach komórkowych. XMRV nie było ani u zdrowych ochotników, ani u nowych pacjentów, ani nawet w próbkach pochodzących od 14 osób, u których wg grupy Mikovits dało się wykryć wirusa.

Za to po zastosowaniu takiego samego zestawu odczynników i protokołu PCR, jaki opisał zespół Altera (ten, który znalazł sekwencje podobne do XMRV), grupa Singh zauważyła, że w 5% próbek pojawia się jakiś produkt. Były to sekwencje podobne do XMRV, tak samo, jak u Altera. Po przetestowaniu w tę i z powrotem wszystkich odczynników grupa Singh odkryła, że polimeraza była zanieczyszczona mysim genomowym DNA. A mysie genomowe DNA (i DNA genomowe innych kręgowców) zawiera wbudowane na stałe sekwencje retrowirusowe – nazywa się to retrowirusy endogenne, w skrócie  ERV – a poza tym może zawierać aktywne retrowirusy. W pracy zespołu Altera co prawda również sprawdzano, czy użyte odczynniki nie są aby zanieczyszczone mysim DNA, ale szukano tylko mitochondrialnego DNA, i nie sprawdzono ich pod kątem zanieczyszczeń DNA genomowym.

Praca zespołu Singh opisuje też kłopoty, jakie mieli z zanieczyszczeniem sekwencjami XMRV robota używanego do ekstrakcji DNA z hodoli komórkowych zainfekowanych tym wirusem – nawet po kilku miesiącach qPCR potrafił dać pozytywne wyniki na negatywnych kontrolach. W końcu musieli zrezygnować z używania tego robota.

Autorzy pracy konkludują ‚uważamy, że XMRV nie ma związku z CFS. Jesteśmy zmuszeni uznać, że przepisywanie leków antywirusowych chorym na CFS jest nieuzasadnione i może być potencjalnie niebezpieczne‚.

Ale to nie wszystko. W Science pojawiła się praca (6), w której Levy i jego grupa zbadali próbki pochodzące od 43 pacjentów z CFS, u których albo Mikovits albo Alter wykryli XMRV i podobne sekwencje. I tak samo jak Singh, również ci badacze nie znaleźli ani sekwencji wirusowych, ani przeciwciał anty-XMRV/MLV. Do tego surowica pobrana od tych samych pacjentów z CFS inaktywowała domieszane do niej wirusy XMRV (tak samo zresztą, jak surowica zdrowych ludzi), co nienajlepiej świadczy o ich możliwościach infekowania ludzi. Dodatkowo badacze wykryli zanieczyszczenia mysim DNA zawierającym ERV w połowie używanych w laboratoriach polimeraz i przeciwciał, którym się przyjrzeli. Sekwencje, które uzyskali z odczynników, przypominały sekwencje znajdywane przez Mikovits i Altera u pacjentów z CFS. A na koniec porównali 3 sekwencje uzyskane przez Mikovits do klonu VP62 – pierwszej sekwencji XMRV, którą wyizolowano w 2006. Były identyczne. A przecież gdyby to był namnażający się wirus, należałoby się spodziewać, że między sekwencjami będzie już trochę różnic. Badacze doszli więc do wniosku, że próbki zostały zanieczyszczone oryginalnym klonem VP62.

I ostatni gwóźdź do trumny – kolejna praca w Science (7), której autorzy spróbowali dojść do tego, skąd się wziął wirus XRMV. Wyniki opisane w tym artykule sugerują zresztą, że XMRV nie ma nic wspólnego nie tylko z CFS, ale i z rakiem prostaty.

Mysz nude - czy to one stworzyły wirusa XMRV? (© Armin Kübelbeck)

Na samym początku tej długiej notki wspominałam, że XMRV wyizolowno po raz pierwszy z ludzkiego nowotworu prostaty. Tak dokładnie, to chodzi o linię komórkową 22Rv1, wyprowadzoną z raka prostaty (CWR22). Zrobiono to w ten sposób, że komórki nowotworowe wszepiono myszy, kiedy guz urósł, przeszczepiono go kolejnej, i tak dalej, i tak dalej. W opisywanej pracy porównano próbki pobrane z początkowych pasaży i okazało się, że nie zawierają one XMRV. Za to u myszy ze szczepów, w których pasażowano tę linię, naukowcy znaleźli dwie niemal identyczne sekwencje retrowirusowe (PreXMRV-1 i -2). Analiza tych sekwencji sugeruje, że XMRV powstał w wyniku ich rekombinacji.  W sumie autorzy przebadali myszy z 89 różnych szczepów i ani razu nie wykryli XMRV. Oznaczałoby to, że XMRV to nowy mysi retrowirus, który powstał przypadkowo w laboratorium, prawdopodobnie mniej więcej w 1993-1996 roku.

 Po tych dwóch ostatnich publikacjach redaktorzy Science zasugerowali Mikovits, że powinna wycofać swoją pracę. Jak na razie Mikovits tego nie zrobiła, za to w Science można znaleźć tzw. ‚Expression of concern’, czyli komentarz redakcji objaśniający, że kolejne prace nie potwierdziły wyników Mikovits, a także sugerujący, że w zależności od wyników prowadzonych obecnie przez NIH badań nad związkiem XMRV i CFS redakcja podejmie ostateczną decyzję, co z tym fantem zrobić.

Cóż, polityka dotycząca wycofywnia publikacji różni się między czasopismami, ale według wytycznych COPE powodem mogą być:

• nieetyczne badania;
• plagiat;
• publikowanie tych samych wyników wielokrotnie;
• i wreszcie nieprawdziwe/nierzetelne wyniki, czy to na skutek sfabrykowania danych, czy też na skutek popełnionego przez autorów błędu, nawet bez złej woli.

Czy w związku z tym pracę Mikovits rzeczywiście należy wycofać? Póki co mam mieszane uczucia.

Oczywiście mimo tych wszystkich wątpliwości są firmy (np. firma związana z prywatnym instytutem badawczym, w którym pracuje Mikovits), które już oferują niezaaprobowane przez FDA i niesprawdzone niezależnie badania diagnostyczne, które ponoć wykrywają XMRV.  Dodatkowo sądząc po tym, co pisze w końcówce swojego artykułu Singh, niewykluczone, że czasem stosowane są leki antyretrowirusowe. A przecież mogą one mieć skutki uboczne, a jak dotąd niemal nic nie wskazuje na to, że CFS jest powodowany przez retrowirusy.

---

1.Urisman A, Molinaro RJ, Fischer N, Plummer SJ, Casey G, et al. (2006) Identification of a Novel Gammaretrovirus in Prostate Tumors of Patients Homozygous for R462Q RNASEL Variant. PLoS Pathog 2(3): e25. doi:10.1371/journal.ppat.0020025
2. Schlaberg, R. (2009-09-22) XMRV is present in malignant prostatic epithelium and is associated with prostate cancer, especially high-grade tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences, 18(17), 4700-16356. DOI: 10.1073/pnas.0906922106
3.Lombardi VC, Ruscetti FW, Das Gupta J, Pfost MA, Hagen KS, Peterson DL, Ruscetti SK, Bagni RK, Petrow-Sadowski C, Gold B, Dean M, Silverman RH, & Mikovits JA (2009). Detection of an infectious retrovirus, XMRV, in blood cells of patients with chronic fatigue syndrome. Science (New York, N.Y.), 326 (5952), 585-9 PMID: 19815723
4.Lo SC, Pripuzova N, Li B, Komaroff AL, Hung GC, Wang R, & Alter HJ (2010). Detection of MLV-related virus gene sequences in blood of patients with chronic fatigue syndrome and healthy blood donors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107 (36), 15874-9 PMID: 20798047
5. Shin CH, Bateman L, Schlaberg R, Bunker AM, Leonard CJ, Hughen RW, Light AR, Light KC, & Singh IR (2011). Absence of XMRV and other MLV-related viruses in patients with Chronic Fatigue Syndrome. Journal of virology PMID: 21543496
6.Knox K, Carrigan D, Simmons G, Teque F, Zhou Y, Hackett J Jr, Qiu X, Luk KC, Schochetman G, Knox A, Kogelnik AM, & Levy JA (2011). No Evidence of Murine-Like Gammaretroviruses in CFS Patients Previously Identified as XMRV-Infected. Science (New York, N.Y.) PMID: 21628393
7.Paprotka T, Delviks-Frankenberry KA, Cingöz O, Martinez A, Kung HJ, Tepper CG, Hu WS, Fivash MJ Jr, Coffin JM, & Pathak VK (2011). Recombinant Origin of the Retrovirus XMRV. Science (New York, N.Y.) PMID: 21628392